一、实验目的

构建标准化的雄性小鼠急性化学性肝损伤模型，模拟人类化学性肝损伤的病理状态，为探究肝损伤发病机制、筛选保肝药物、验证肝损伤诊断标志物提供可靠的实验载体。通过该模型可精准观察肝细胞损伤的病理变化，为后续相关实验提供统一、可控的研究对象。

二、实验意义

该模型可助力明确化学性肝损伤的核心致病通路，为临床保肝药物研发、肝损伤早期诊断技术优化提供实验支撑，同时为肝损伤修复机制及相关干预手段的研究奠定基础，具有重要的实验价值和临床参考意义。其研究结果可推动肝损伤相关基础医学研究的深入，为临床治疗化学性肝损伤提供新的思路和实验依据，也能规范相关实验研究的标准化流程。

三、模型原理

CCl₄本身无直接肝毒性，进入小鼠体内后会优先富集于肝脏，经肝细胞内质网中的细胞色素P450 2E1（CYP2E1）代谢活化，生成高活性的三氯甲基自由基（CCl₃）和三氯甲基过氧自由基。

这些自由基会迅速攻击肝细胞的细胞膜与细胞器膜，引发剧烈的脂质过氧化反应，破坏膜结构完整性，导致肝细胞通透性增加、钙超载，最终引发肝细胞水肿、脂肪变性、坏死与凋亡；同时会激活炎症通路，诱导大量炎症细胞浸润，进一步加重肝损伤。

最终表现为血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）急剧升高，肝脏出现典型的急性肝损伤病理改变，完美模拟临床化学性急性肝炎的病理生理过程。

四、实验动物选择与饲养条件

SPF 级C57BL/6小鼠（5-7周龄），雄性。

选用雄性动物主要是由于其肝脏细胞色素 P450 酶系活性显著高于雌性，对四氯化碳代谢产生的毒性自由基更为敏感，能够快速形成稳定的急性肝损伤模型，有效避免雌性动物体内性激素波动对模型稳定性及实验结果造成的干扰。

饲养条件：恒温（22 ± 2 ℃），恒湿（50 %-60 %），12 h光暗循环，自由摄食饮水，适应性饲养3天后开始实验。

五、试剂与耗材

1. 试剂：分析纯四氯化碳（CCl₄）、橄榄油（优先选择，刺激性更小、吸收更稳定，也可选用玉米油）；严禁用无水乙醇、生理盐水为溶剂，CCl₄不溶于水，有机溶剂会加重肝损伤，严重干扰实验结果。

2. 耗材：1mL无菌注射器、镊子、手术剪、无菌采血管。

六、模型制作与样本采集

1. CCl₄溶液配制

浓度：根据预实验确定（常用0.5 % - 2 % CCl₄，溶于橄榄油）。

配制方法：

① 取适量CCl₄，按体积比（如1%）加入橄榄油，涡旋混匀。

② 现配现用，避免挥发。

2. 动物分组与给药

分组（示例）：

对照组：橄榄油腹腔注射（5mL/kg）。

模型组（CCl₄）：0.5 % - 2 % CCl₄ 溶液腹腔注射(5mL/kg) 。

每组6-8只小鼠，避免个体差异。

给药方式：

腹腔注射（推荐）或灌胃（需注意操作准确性）。

注射前禁食4-6小时（提高模型稳定性）。

3. 观察与样本采集

（时间点：急性肝坏死通常在给药后 24-48小时达到高峰（需预实验验证）。

观察指标：

① 一般状态：活动度、毛色、食欲、体重变化。

②血清采集：

麻醉小鼠，眼眶取血或心脏穿刺，静置30min后离心（3000r/min,10min）分离血清。

检测ALT、AST（肝功能标志酶）。

③肝脏采集：

颈椎脱臼处死小鼠，快速取出肝脏。

称重，计算肝指数（肝脏重量/体重×100%）。

取部分肝组织置于10%福尔马林固定（病理分析)，剩余组织液氮速冻后-80℃保存（后续分子实验)。

4.病理学分析

HE染色：

①固定肝组织经脫水、包埋、切片(4 μm)。

②HE染色后观察：

肝坏死区域（细胞核碎裂、溶解，炎性浸润)。

脂肪变性（空泡化）。

评分标准：

根据坏死面积百分比评分（如0-4分∶无、轻度、中度、重度)。

七、模型应用

1.探究化学性肝损伤发病机制：明确四氯化碳诱导肝细胞坏死、脂质过氧化及炎症反应的相关通路，为肝损伤机制研究提供实验支撑。

2.保肝药物筛选与评价：筛选潜在保肝药物，评估药物疗效、最佳给药剂量及安全性，为临床保肝药物研发提供依据。

3.肝损伤生物标志物验证：验证肝损伤相关生物标志物的敏感性和特异性，助力临床化学性肝损伤的早期诊断。

4.肝细胞修复与再生研究：探究肝细胞修复、再生的调控机制，评估干细胞移植、基因治疗等新型干预手段的效果。

5.肝毒性安全性评价：用于化工、医药等领域产品的肝毒性检测，为产品安全性评估提供实验数据。

八、注意事项

1. 溶剂选择：优先选用橄榄油或玉米油，脂溶性溶剂，可减少 CCl₄对动物胃肠道、腹腔的刺激。

2. 一般给予CCl₄ 3h后，ALT、AST开始升高，最高可升高到正常值的10倍。

3. 应设置预实验，确定合适的试剂浓度、最佳取材时间，避免剂量过高引起动物死亡，以及规避因取材时间不当未能获取有效数据浪费实验动物的现象。

九、对动物可能造成的预期伤害及解决措施

（一）预期伤害

1.部分动物出现溏泻（腹泻）症状，用手触摸可见动物脊柱两侧肌肉层消失、骨感明显，提示存在肌肉萎缩及严重体重下降。

2.四氯化碳可导致心脏、肺、肾脏出现不同程度的肿胀、出血、坏死及炎性细胞浸润，未被肝脏完全代谢的药物会对这些器官造成额外损害。

3.急性肝衰竭可引发肝性脑病，出现浅昏迷等症状，进一步加重动物痛苦。

（二）解决措施

1.模型优化：可采用复合造模法（如CCl₄联合APAP）以降低单一药物剂量，从而减少CCl₄的肝外毒性。

2.疼痛管理：在不干扰研究目标的前提下，可使用适当的镇痛剂以尽量减少或消除动物的疼痛和痛苦。

3.操作规范：注射前确保CCl₄充分溶解于橄榄油等溶剂，减少局部刺激。腹腔注射时应避开腹正中线和内脏器官，减少不必要的组织损伤。

4.动物福利管理：提供充足的饮水和适宜温度的环境，保持饲养环境清洁。密切监测动物的体重变化、进食情况和精神状态。建议每日至少观察1次，造模后24-48 h增加监测频率。

十、取材与人道终点

（一）取材

严格遵循实验动物福利伦理原则，优先采用过量麻醉法（剂量按动物体重精准配制），确保动物快速进入无意识状态，最大程度减少疼痛与应激反应；待动物角膜反射、呼吸及心跳完全消失后，方可进行后续操作，严禁在动物仍有生命体征时实施解剖。解剖取材需在无菌环境下快速开展，依次分离肝脏、心脏、肺脏、肾脏等目标脏器，操作过程中动作轻柔，避免组织挤压损伤；脏器取材后及时称重、固定，剩余组织按生物安全规范处理，同时做好操作记录，确保实验过程符合动物伦理审查要求。

（二）人道终点

1.人道终点的设立：出现以下情况时应考虑人道安乐死：①快速失去原体重的15%-20%；②动物呈恶病质及持续性肌肉消耗；③动物达到濒死状态无法缓解。

2.实验期间每日观察小鼠精神、饮食、体重变化；严重肝损伤时，动物可能出现呼吸急促、震颤、抽搐等症状，甚至出现濒死状态，此类个体需及时记录；对状态极差、濒死的小鼠及时实施安乐死，减少痛苦。

十一、伦理合规保障

实验前提交动物福利伦理审查申请，获得批准后开展实验；实验过程中严格遵循“3R原则”，尽量减少实验动物用量，优化实验流程，避免不必要的伤害；定期检查饲养环境，保证小鼠饲养条件达标（温度、湿度适宜，饮食、饮水充足），保障小鼠基本福利。